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在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

1. 微量试剂取用前请离心集液。
   
2. Annexin V-FITC避光保存及使用。
   
3. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×10⁵，不推荐用于检测组织样本。
   
4. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
   
5. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
   
6. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

1. 悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；
   注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性。
   
2. 用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×10⁵细胞；
   
3. 加入500μL的Binding Buffer(货号：KFS441)悬浮细胞；
   
4. 加入5μL Annexin V-FITC混匀后，室温避光，反应15～30min；
   
5. 用PBS洗涤细胞一次(2000rpm离心5min)，500μL PBS重悬细胞；
   
6. 室温，避光，孵育5min，上机检测。
   
7. 注：请在1小时内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
   
   1. 荧光显微镜观察
      
      1. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
         
      2. 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
         ① 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
         ② 用PBS洗涤细胞两次；
         ③ 在500μL的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC混匀；
         ④ 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；
         ⑤ 避光、室温反应5min。
         
      3. 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下滤光片(FITC)观察，Annexin V-FITC荧光信号呈绿色。
   2. 流式细胞仪分析
      
      1. 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm;发射波长Em=525nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测。